制備感受態(tài)細(xì)胞與轉(zhuǎn)化
制備感受態(tài)細(xì)胞：
1、從37℃培養(yǎng)16-20h的平板中挑取一個單菌落（直徑2-3mm），轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3h。一般經(jīng)驗，1OD600約含有大腸桿菌DH1×109個/ml。
為達(dá)到轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108 細(xì)胞/ml，對于大多數(shù)大腸桿菌來說，這相當(dāng)于OD600值為0.4左右。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高，可每隔15-20min測定OD600 來監(jiān)測，用監(jiān)測的時間及OD600 列一個圖表，以便預(yù)測培養(yǎng)物OD600值達(dá)到0.4的時間，當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。
在菌株和菌株之間，OD600值與每毫升活細(xì)胞數(shù)見的關(guān)系變化很大，因此有必要通過測定特異大腸桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600值，并將各稀釋濃度的培養(yǎng)物鋪于物抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細(xì)胞數(shù)，從而使分光光度計讀數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化。
2、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至.0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3 轉(zhuǎn)頭以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
4、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5、每50ml初始培養(yǎng)液用30ml預(yù)冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。
6、于4℃用Sorvall GS3 轉(zhuǎn)頭以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
7、倒出培養(yǎng)液，將管導(dǎo)致1min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8、每50mo初始培養(yǎng)物用2ml用并預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2（或TFB）重懸每份細(xì)胞沉淀。
9、此時，可以按步驟10-16用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實驗，也可以將細(xì)胞凍存于-70℃。
轉(zhuǎn)化：
包括陽性和陰性對照
10、用冷卻的無菌吸頭從每份用CaCl2溶液制備的感受態(tài)懸液中西區(qū)200ul轉(zhuǎn)移到無菌離心管（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超過10ul的體積，其中的DNA小于50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。
11、將管放入預(yù)加熱至42℃的循環(huán)水浴中，恰恰放置90s，不要搖動管。
熱激是一個關(guān)鍵步驟，準(zhǔn)確地達(dá)到熱敷溫度非常重要。
12、快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min。
13、每管加800ulSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上，溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。
復(fù)蘇期中應(yīng)于37℃溫和地?fù)u動細(xì)胞（用低于50r/min轉(zhuǎn)速的搖床）。
14、將適當(dāng)體積（每個90mm平板達(dá)200ul）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB瓊脂培養(yǎng)基上。
如果用四環(huán)素作為選擇標(biāo)記，全部的轉(zhuǎn)化混合物可以鋪在一個單獨的平米上（或軟瓊脂中），可以現(xiàn)在微量離心機哈桑室溫離心20s以收集轉(zhuǎn)化菌，加100ulSOC重懸沉淀，輕輕混勻。
重要：玻璃鋪菌器需先在乙醇在浸泡，然后在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫后，才可將轉(zhuǎn)化菌輕輕地鋪在瓊脂板上。
如檢查氨芐的抗性，用轉(zhuǎn)化菌鋪平板時密度應(yīng)較低（每個90mm平板不超過104菌落），于37℃培養(yǎng)的時間按不超過20h。氨芐抗性的轉(zhuǎn)化體可將β-內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍區(qū)域的。這樣，鋪平板時密度過高或培養(yǎng)時間按過長都會導(dǎo)致出血對氨芐敏感的衛(wèi)星菌落。在選擇培養(yǎng)基中不用氨芐而用羧芐，以及將抗生素濃度從60ug/ml提高到100mg/ml,可使情況有所改善，但不能產(chǎn)地*之?？拱逼S的增加與平皿上所加的細(xì)菌數(shù)的增加并無線形比例關(guān)系，這可能是因為被抗生素殺死的細(xì)胞釋放生長抑制物質(zhì)的緣故。
15、將平板置于室溫直至液體被吸收。
16、倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12-16h后可出現(xiàn)菌落。
上一篇 氨基酸組分分析 下一篇 石蠟包埋組織切片
